特発性肺線維症：安定と進行性病態での循環血中RNAの違い

循環系に存在しない遺伝子のみを対象として、COPDを含むサンプルで、IPF標本と対照比較

COPDでもいくらか共通の遺伝子変化が認められた。循環中バイオマーカーを特徴づけることができれば、IPFの病態や進行だけでなく、COPDのような他の慢性線維化/リモデリング肺疾患についても理解が深まる可能性がある

 IPFの進行性と安定性の間で遺伝子発現に統計的に有意な差が認められたが、傾向が認められたので、真の有意性を確認するためには、より大きなコホートが必要である。

 また、関与しているタンパク質の多くは、IPFの発症機序に関与している可能性があり、これらのバイオマーカーに焦点を当てた将来の機能研究が必要とされている。

Circulating RNA differences between patients with stable and progressive idiopathic pulmonary fibrosis

Britt Clynick, et al.

European Respiratory Journal 2020 56: 1902058; 

https://erj.ersjournals.com/content/56/3/1902058

DOI: 10.1183/13993003.02058-2019

ベースラインのFVCとDLcoを採血時から±6カ月間評価し、線形回帰モデルを用いてベースラインの肺機能から縦断的なFVCとDLcoの軌跡を±6～12カ月間決定

ベースラインから6～12ヶ月以内にFVC≧10％および/またはDLco≧15％の低下が認められた場合、進行性IPFを定義

各群10名の患者の血漿を分離し、RNAを抽出した。135,000以上の転写産物の発現をマイクロアレイ（Human Clariom D; ThermoFisher Scientific）を用いて解析し、安定型と進行型のIPFサンプル間で発現プロファイルを比較

2つのIPF群間で2倍以上の差があるトップターゲットを同定し、液滴デジタルPCR（ddPCR、BioRad）を用いて、安定型（n=33）と進行型（n=24）の独立したコホートと無病型（n=15）のIPF患者との間で、発現の差を検証し、絶対的な発現測定値を比較

サンプルを数千個の均一なナノリットルサイズの液滴に分割し、エンドポイントPCRを行い、テンプレート濃度を、検出可能な陽性液滴（増幅ターゲットを含む）と陰性液滴（増幅ターゲットを検出しない）の比率のポアソン統計分析を用いて決定

IPF（ホルマリン固定パラフィン包埋）IPF5検体、健常肺対照4検体、IPFと正常線維芽細胞株、および疾患対照群として使用したCOPD血漿5検体について、IPF患者循環中に検出された遺伝子の発現を確認するための解析

遺伝子発現量の予測性能は、年齢FVCベースライン、性別、GAPステージを調整したCox比例ハザード回帰分析を用いて検討し、主成分分析(PCA)を用いてグループ間およびグループ内の全体的な変動性を調べた

平均年齢はIPF安定群で71±7歳（n=33，男性21名），IPF進行群で65±10歳（n=24，男性15名），健康対照群で62±10歳（n=15，男性8名）であった。ベースラインでの肺機能は予測比で、安定群ではFVC79±26％、DLco49±15％、進行群ではFVC78±18％、DLco43±13％

ddPCRにて 8つのtranscript(TAF2、NT5C2、JAK1、 TAOK1、 TRAM1、RP11-726G23.6、 MIR6841)のうち７つが、PFと対照で違いを見いだした

ddPCRの検証で、IPF肺組織およびIPF線維芽細胞において、健康な肺組織および正常なコントロールから得られた線維芽細胞と比較して、7つの転写物のより高い発現を確認した。免疫組織化学（IHC）による免疫局在化染色は、有意に発現したTAF2を特徴付けるために、5つのIPF肺FFPEサンプルで実施された。より強いTAF2の発現は、気管支上皮細胞、肺胞上皮細胞、平滑筋細胞および線維芽細胞の細胞質で観察されたIPF組織（図1B）は、健康な肺（図1C）と比較して（図1B）。TAF2の発現は多変量Cox回帰において死亡率の増加を予測した（p<0.05）。PCAにより、TAF2とRP11-726G23.6の発現はIPFの進行状況と正の予測関係を示した（p=0.036）。

興味深いことに、COPD患者の循環中の遺伝子発現解析では、MIR6841以外のすべての遺伝子において、健常者と比較して有意に発現量が増加しており（p=0.055）、エビデンスの強さが中程度であったことから、慢性線維化・リモデリング肺疾患におけるこれらの遺伝子の関連性の可能性が示唆された。

TAF2(TAA-Box Binding Protein Associated Factor-2)は、RNAポリメラーゼIIの中核となる転写機構の重要な構成要素をコードしている。  TAFタンパク質は、IPFの発症に重要な因子である分化・増殖を制御している。

興味深いことに、Human Protein Atlas Tissue Gene Expression Profilesのデータセットから得られた肺のデータによると、TAF2の発現は肺の全細胞型と比較して、肺細胞と内皮細胞で50～75％を占めていることが報告されている

NT5C2 (5'-Nucleotidase, Cytosolic-II)は、細胞内プリン代謝や細胞生存に重要な役割を果たすヒドロラーゼをコードしています。その機能は細胞内ヌクレオチドプールのホメオスタシスの維持に関与していることが示唆されており、IPFでのさらなる研究が必要である。

JAK1（Janus Kinase 1）は、分化、増殖、生存、遊走に関与するいくつかのシグナル伝達経路の活性化に関与するチロシンキナーゼタンパク質であり、JAK1の下流で作用するSTAT3は、線維芽細胞の表現型の主要な調節因子である。

TAOK1（Thousand And One Amino Acid Protein Kinase-1）は、ストレス活性化MAPK経路に関与するプロテインキナーゼをコードし、DNA損傷応答やアポトーシスを制御している。　MAPKシグナル伝達カスケードは、EMTなどの梗塞発生に関わる細胞の制御に関与していることが知られている。　TAOK1はIPFでは報告されていないが、α平滑筋アクチン（α-SMA）の過剰発現を介して肝線維化を悪化させることが報告されている。

TRAM1(Translocation Associated Membrane Protein-1)は、哺乳類の小胞体(ER)の一部を形成し、その膜上でタンパク質の移動を促進するタンパク質をコードしている。TRAM1はERストレス下でアップレギュレーションされており、IPFに関連している可能性がある。

RP11-726G23.6とMIR6841は、タンパク質をコードする能力を失ったノンコーディング遺伝子である。

MIR6841は、IPFには記載されていないが、肺線維症との関連が知られているmTORC2（Mammalian Target of Rapamycin Complex-2）のサブユニットを形成するタンパク質コード遺伝子であるRICTOR（RPTOR Independent Companion of MTOR Complex-2）と関連している